LPK基因在非酒精性脂肪肝中的表观遗传学研究

【摘要】非酒精性脂肪肝(Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)严重危害人类健康。丙酮酸激酶基因(L-typepyruvatekinase,LPK)是糖酵解通路中的关键基因之一,多个关联研究结果都显示LPK基因和非酒精性脂肪肝的发生有显著相关性,为此,我们在NAFLD模型中开展了LPK基因表观遗传学研究。首先,通过棕榈酸(palmiticacid,PA)诱导大鼠肝脏细胞(BRL)制备了NAFLD细胞模型,通过高脂饮食喂养SD大鼠建立了NAFLD大鼠模型。在两种NAFLD模型中LPK基因的mRNA和酶活性都显著下降(P<0.01),LPK蛋白表达量在BRL细胞模型中也有明显下调。在人肝细胞(Q,SG7701)中过量表达LPK基因,可显著提高细胞增殖速率(P<0.05)、加快葡萄糖消耗速度(P<0.01)、增强细胞甘油三酯代谢速率(P<0.01)；抑制LPK基因表达后,上述指标均显著下降,显示LPK基因对于细胞增殖、糖脂代谢具有重要的调控作用。盐酸小檗碱(Breberine,BBR)对NAFLD细胞和动物模型进行干预后,均可以显著提高LPK基因的表达和酶活性(P<0.01)。在此基础上,该论文从DNA甲基化,组蛋白乙酰化和miRNA调控三方面研究NAFLD模型中表观遗传学修饰对LPK基因表达的影响：1.NAFLD大鼠和细胞模型中LPK基因启动子区域CpG位点的甲基化程度显著高于正常对照组(P<0.05)。荧光素酶(Luc)报告系统表明LPK基因启动子区域甲基化程度升高会显著降低(P<0.01)LPK基因启动子活性。高效液相色谱(HPLC)实验显示：两种NAFLD模型的基因组DNA整体甲基化水平均显著降低(P<0.01)。定量PCR结果显示DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达量在两种NAFLD模型中均显著降低(P<0.05)。BBR药物干预可以显著降低(P<0.05)LPK基因启动子区域各CpG位点的甲基化程度；提高部分DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达量,从而升高基因组DNA的整体甲基化水平(P<0.05)。2.染色质免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)实验发现两种NAFLD模型中LPK基因DNA区域组蛋白H3、H4的总体乙酰化程度均显著低于对照组(P<0.01)。BBR药物干预可以选择性降低LPK基因DNA区域组蛋白H3、H4的总体乙酰化程度(P<0.05)。NAFLD大鼠模型中LPK转录调控因子ChREBP与LPK启动子区域的结合量减少(P<0.01)。3.microRNA.org网站预测LPK3’-UTR区域存在miR-15b作用序列。定量PCR检测发现,miR-15b表达量在NAFLD细胞和动物模型中都显著升高(P<0.01)。在QSG7701细胞中转染miR-15b会显著降低LPK的mRNA表达量(P<0.01)、降低细胞增殖速率(P<0.01)、减少葡萄糖消耗量(P<0.05),减慢甘油三酯的代谢速度(P<0.05)。Luc报告系统显示miR-15b可以显著降LPK3’-UTR的活性,说明miRNA-15b能够抑制LPK酶的表达。此外,在我们收集的37例健康人和64例脂肪肝患者的血清的miRNA定量检测中,发现脂肪肝患者血清中miR-15b的表达量显著高于(P<0.01)健康人。这提示miR-15b可能是潜在的血清标志物综上所述,本课题从表观遗传学的三个方面：DNA甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA调控初步探索了LPK基因在NAFLD模型中表达调控机制,BBR治疗NAFLD的机制之一可能是通过逆转其表观修饰从而恢复LPK基因表达,改善糖脂代谢。
【作者】张玉皓；
【导师】卢大儒；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2012，博士
【关键词】NAFLD；LPK基因；DAN甲基化；组蛋白乙酰化；miR-15b；ChREBP；小檗碱；

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